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    教你如何做分子構(gòu)建,從此邁向科研達(dá)人!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-25  點(diǎn)擊次數(shù): 1497次

    做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的人都知道,要想做的有效率有質(zhì)量是很苦逼的,1 個(gè)月做 100 個(gè)克隆那都是 小 case,沒(méi)點(diǎn)看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因,周旋個(gè)把月,那也是家常便飯。下面就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn),從此邁向科研達(dá)人!


    1. 準(zhǔn)備工作 

    俗話說(shuō):用欲善其事,必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具,效果事半功倍哦。 推薦兩個(gè)工具,一個(gè)是 oligo 軟件,常用于引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析;另一個(gè)是 DNAstar 軟件,工具*大,一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件,用作 DNA 和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。


    2. 設(shè)計(jì)引物 

    1) 注重要:看懂質(zhì)粒圖譜!拿大家比較熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 質(zhì)粒,設(shè)計(jì)引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉,不要辛辛苦苦的一路做下來(lái) 結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白,你就死了;C1 質(zhì)粒,注意閱讀框,要是移碼了,你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3,要弄清楚別弄竄了。一句話,要看懂你的圖譜!

    其他需要注意:

    *設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加保護(hù)堿基(大家要用 T 載體就當(dāng)我沒(méi)說(shuō)); 

    *酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則:盡量用粘性末端,實(shí)在不行就用一些常用平端酶,如 EcoRV 和 SnaB1 等,要是以后還有別的用處就多加點(diǎn)酶切位點(diǎn),曾一口氣在引物上加了五個(gè)酶切位點(diǎn)以防以后要用到,注意計(jì)算 TM 值的時(shí)候要減去這些不匹配的序列; 

    *注意 KOZAK 序列的問(wèn)題,很多質(zhì)粒沒(méi)有提供 KOZAK 序列,這要在設(shè)計(jì)的時(shí)候直接在引物上加好。 

    *擅用 Gene Overlap,比方說(shuō)加個(gè) flag 標(biāo)簽,his 標(biāo)簽,my 標(biāo)簽之類的,直接設(shè)計(jì)三引物 overlap 一下就可以,省得還要再多構(gòu)建一步,這些都是設(shè)計(jì)引物時(shí)候就要考慮好的。引物長(zhǎng)一點(diǎn)不要緊(兩步法),尤其是對(duì) GC 比高的序列,有時(shí)候引物不長(zhǎng) PCR 根本不出結(jié)果,注意如果 GC 比較高,這個(gè)時(shí)候 Gene Overlap 就不要做了,很麻煩,克隆很難挑。 

    *沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)?很簡(jiǎn)單,用同尾酶策略,比方說(shuō) Bgl2 和 BamH1,Nhe1 和 spe1,Xho1 和 Sal1(注意連上了切不下來(lái)),實(shí)在不行就平端吧。


    3. PCR 擴(kuò)增 

    如果沒(méi)有現(xiàn)成的質(zhì)??晒┟盖?,PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可選擇的 PCR 酶實(shí)在太多,每隔一段時(shí)間還會(huì)升級(jí),正常情況下,高保真的 taq 酶都能滿足需求。但如果遇到難 PCR 的高 GC 基因,可以換不同 PCR 酶,添加一些 DMSO,甘油等,實(shí)在不行可以考慮 Clontech 的 2 GC rich kit,價(jià)格和實(shí)力都大牛。另外,建議電泳切膠回收純化 PCR 產(chǎn)物, 去除一些非特異性條帶。


    4. 酶切 

    強(qiáng)烈推薦 NEB 的內(nèi)切酶,記得有一次用別家的酶切過(guò)夜,結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了(當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高),而用 NEB 的酶,切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切 OK,尤其現(xiàn)在 NEB 還推出了 HF 的內(nèi)切酶,沒(méi)有星活性而且統(tǒng)一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也還可以。


    5. 連接 

    常用的是 NEB 的 T4 連接酶,很好用,但是注意 Buffer 里有 ATP,反復(fù)凍融 ATP 失活很快, 拿到 buffer 后就分裝,10uL/管,一次性使用。

    載體總量:一般來(lái)說(shuō),載體濃度在 20-100ng/uL 較好,太低的話碰撞幾率低,太高的話又會(huì)產(chǎn)生很多非目的克隆,總量從 50-100ng 就可以,太低失敗幾率很高,太高克隆太多,挑克隆會(huì)很麻煩,反應(yīng)總體積也有講究,體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低,而且對(duì)感受態(tài)細(xì)胞也是個(gè)挑戰(zhàn),通用 10-15uL。


    載體和插入片段比例:載體和插入片段比例一般是 1:7,如果很難連接,比如說(shuō)平端連接,要適當(dāng)提高片段濃度,同時(shí)加大比例 1:10。


    6. 轉(zhuǎn)化 

    按照 SOP 做就行,話說(shuō)實(shí)驗(yàn)室原來(lái)從 takara 買感受態(tài)(competent cell),后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高(protocol 免費(fèi)索?。?span style="font-size: 20px;">要注意的是 LB 必須無(wú)菌而且沒(méi)有抗生素。


    7. 鑒定 

    想要快速鑒定,建議用菌液 PCR,菌液 PCR 是有一定講究的,很多人做菌液 PCR 鑒定假陽(yáng)性特多,為什么?因?yàn)槟?PCR 引物選的都在載體上,注意引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn),PCR 方法鑒定是極其準(zhǔn)確的,數(shù)百次菌液 PCR 經(jīng)驗(yàn)。PCR 鑒定做起來(lái)也很簡(jiǎn)單, 拿個(gè) 2mL tube,裝 0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的 LB,搖個(gè)三小時(shí)左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快,直接菌落 PCR 也不錯(cuò),效果一樣。


    8. 測(cè)序 

    拿到測(cè)序結(jié)果時(shí),不僅要核對(duì)序列,還要看測(cè)序峰圖,這很重要。因?yàn)橛袝r(shí)候光看序列對(duì),實(shí)際上圖顯示的不對(duì),或者雖然序列結(jié)果不對(duì),但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信,出現(xiàn)突變也不怕,有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子;還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭"的地方,因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò),比方說(shuō)少個(gè)堿基什么的,還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一兩個(gè)堿基什么的,如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無(wú)及。



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