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細(xì)胞勻漿的操作
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-24 點(diǎn)擊次數(shù)： 3519次材料與儀器
細(xì)胞
緩沖鹽溶液 二異丙基氟瞬酸 勻漿緩沖液
相差顯微鏡步驟
1. 準(zhǔn)備下面的貯液和材料。
等滲的緩沖鹽溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO4，pH 7.2)
二異丙基氟瞬酸（DIFP）
1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0
0.5 mmol/L K+EGTA，pH 7.0
0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0
0.1 mol/L DTT
NaN3
蛋白酶抑制劑
PMSF
抑胃酶肽 A
亮抑酶肽
刀豆胰蛋白酶抑制劑
勻漿緩沖液：
0.34 mol/L 蔗糖
20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0
5 mmoI/L K+EGTA，pH 7.0
5 mmol/L K+ATP，pH 7.0
5 mmol/L DTT ( 干粉或用貯存液）
50 μmol/L PMSF
3 mmol/L NaN3
22 μmol/L 抑胃酶肽 A
1.2 μmol/L 亮抑酶酞
10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制劑
PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更穩(wěn)定，但更貴。
2. 洗細(xì)胞：輕輕地沉降細(xì)胞（例如 3000 g 離心 5 分鐘），去掉培養(yǎng)基，通過(guò)振搖打碎沉淀物，然后重懸于至少 10 倍體積冰冷的等滲緩沖鹽水中。再次在新鮮的等滲緩沖鹽水中沉降和重懸，總共 3 次。對(duì)于不同的細(xì)胞類(lèi)型，離心力和時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行優(yōu)化。
3. 最終的冰冷的細(xì)胞懸液中補(bǔ)加 DIFP，使終濃度為 5.7 mmol/L（每毫升細(xì)胞懸液中加 1 μl）。冰浴 5 分鐘。
4. 上述的步驟 2 沉降細(xì)胞，然后重懸于 4~6 倍勻漿緩沖液中。
5. 細(xì)胞勻漿要造成最大破壞，但要盡量減少氧化。
6. 用相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的裂解，證實(shí)超過(guò) 99% 都已經(jīng)裂解了。
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