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    從96孔微培養(yǎng)板生長的哺乳動物細胞中分離DNA

    發(fā)布時間: 2021-12-20  點擊次數(shù): 951次

    原理

    本方案由 Ramirez-solis 等的方法 1992,1993 改進而成,是一種從微培養(yǎng)板的每個孔生長的真核細胞抽提基因組 DNA 的簡便有效的方法。每個孔產生的基因組 DNA 足以做數(shù)次聚合酶鏈反應(PCR) 或者一次 Southern 雜交。對于制備用于 PCR 反應的基因組 DNA 的最佳方法。

    材料與儀器

    限制性內切核酸酶 無 DNase 的 RNase 細胞
    細胞裂解緩沖液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸鹽緩沖液 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE
    抽氣設備 多通道移液器 溫箱 振搖平臺 Tupperware 容器

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液和溶液

    細胞裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),10 mmol/L NaCl,0.5% (m/V) Sarkosyl)

    乙醇

    NaCl/乙醇溶液

    磷酸鹽緩沖液(PBS )

    蔗糖凝膠上樣緩沖液

    TE (pH 8.0)

    2. 酶和緩沖液

    限制性內切核酸酶

    無 DNase 的 RNase

    3. 專用設備

    與帶閥門的真空管相連的抽氣設備

    多通道移液器,8 或 12 道

    溫箱,預設至 60℃。

    振搖平臺

    Tupperware 容器

    4. 細胞和組織

    在 96 孔微培養(yǎng)板上生長的細胞

    二、方法

    1. 用藍色尖頭或者巴斯德移液管吸去 96 孔培養(yǎng)板每個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液。

    只要小心不接觸細胞層,通常不用毎個培養(yǎng)孔換新的尖頭。

    2. 每個培養(yǎng)孔中的細胞用 100 μl 磷酸鹽緩沖液沖洗 2 次。

    3. 用多通道移液器在微培養(yǎng)板的每個孔中加入 50 μl 細胞裂解液。將數(shù)張濕的吸水紙置入一個聚丙烯盒中(如 Tupperware 盒),再將盛有細胞裂解液和細胞的微培養(yǎng)板放在吸水紙上,用蓋封嚴盒子。

    4. 將封好的盒子在 60℃ 溫箱中溫育 12~16 h。

    5. 將盒子移出溫箱,取出培養(yǎng)板平放在工作臺上,冷卻數(shù)分鐘,每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混勻,直接將培養(yǎng)板于室溫溫育 30 min。溫育末期應見到纖維狀的核酸沉淀。

    6. 緩慢地倒轉培養(yǎng)板,將乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀應黏附在培養(yǎng)孔的底部。將每個培養(yǎng)板倒置于干燥的吸水紙上,使殘余乙醇從培養(yǎng)板流出。

    7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇,小心不要移動核酸沉淀。按步驟 6 倒轉培養(yǎng)板以去除 70% 乙醇。在吸水紙吸去多余的液體。用 70% 乙醇再沖洗沉淀 2 次。

    8. 使培養(yǎng)板在室溫干燥直至最后的乙醇揮發(fā)。如果基因組 DNA 將用于 PCR 分析,進行步驟 9。如果 DNA 將用于 Southern 雜交,進行步驟 10、11 和 12。

    9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室溫緩和地震搖 12~16 h 使 DNA 溶解。

    10. 如果 DNA 將用于 Southern 雜交,制備下列限制性內切核酸酶混合物;每孔需 40 μl。

    H2O                                      0.8倍體積

    10X限制性內切核酸酶緩沖液   0.1倍體積

    無 DNase 的 RNase               10 μg/ml

    使用前每 40 μl 混合物加入 10 個單位限制性內切核酸酶。

    11. 用多通道移液器在每個孔中加入 40 μl 限制性內切核酸酶反應混合物。反復抽吸數(shù)次使孔中內容物混合,小心避免產生氣泡。按步驟 3 用 Tupperware 容器制作濕盒, 將培養(yǎng)板放入,使反應在適宜的消化溫度溫育 12~16 h。

    12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液終止反應,進行 Southern 印跡和雜交以分析消化的 DNA。

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    安培生物科技有限公司介紹:

    安培生物堅持為生命科學研究、活體動物轉染、大規(guī)模生物生產、基因和細胞治療領域客戶,提供*細胞體內可代謝的核酸轉染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動物血清產品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產,包括培養(yǎng)間充質干細胞和多種免疫細胞系等,為制藥公司或者生物技術公司提供無血清細胞培養(yǎng)規(guī)模生產服務;提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養(yǎng)可分解3D基質膠產品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領域提供優(yōu)質的產品和技術服務,努力發(fā)展為基因治療、細胞治療的生物科技企業(yè)。



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